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　　第二章 微生物代谢调节 微生物的新陈代谢错综复杂，参与代谢的物质又多种多样，即使同一种物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。 微生物的生命活动是由产能与生物合成的各种代谢途径组成的网络，互相协调来维持的。 可以把微生物看作是一个奇妙的超微型化学工厂。 Figure 2: Interactions between functional groups. Numbers in parentheses indicate, first, the number of interactions within a group, and second, the number of proteins in a group. Numbers near connecting lines indicate the number of interactions between proteins of the two connected groups. For example, there are 77 interactions between the 21 proteins involved in membrane fusion and the 141 proteins involved in vesicular transport (upper left corner); 23 protein interactions connect the 21 proteins involved in membrane fusion. Only connections with 15 or more interactions are included here. Note that only proteins with known function are shown (many of these have several functions). The sum of all interactions in this diagram is therefore smaller than the number of all interactions. Nature Biotechnology Vol 18:1258 (2000) 在长期的进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格地控制代谢活动，使之有序而高效地运行，并能灵活地适应外界环境，最经济地利用环境中的营养物。 微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点。目前，人们对此了解还十分有限。 微生物的代谢网络是受到高度调节 在1 μg（1(10-6 ml ）体积这么小的细胞里，i20min复制一代，每个细胞含蛋白质分子数为1.7 (106 每秒中要合成1400个蛋白质分子，如每个分子平均含有300个共价键，每秒要形成 420，000个肽键。化学家合成第一个蛋白质花 了几个月的时间。 新陈代谢具有三大特点： 1 、生物反应都在温和条件下进行，大多为酶所催化 2、反应具有顺序性 3、具有灵敏的自动调节机制。 微生物除具有内源性调节机制外，对外界反应也有自我调节的能力。受到诸如离子、激素、代谢物等特异或非特异信息的刺激时，可以调整自己的酶活性水平、基因表达水平，给出正调节（激活）或负调节（抑制），以适应外界环境的变化。 本章将主要讨论对酶的调节。微生物细胞内的遗传物质上储存着能催化所有生化反应所需的酶以及调节酶活性的信息。微生物可以按照适应环境的需要调节酶的表达(即酶蛋白的合成)及调节酶的活性(即酶的激活或抑制)。 了解微生物的代谢调节系统不仅有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生物和为微生物提供最适合的环境条件，使微生物能最大限度地生产人类所需的代谢产品。 2.1??酶合成的调节 酶合成的调节是通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、也是缓慢的。它的优点是通过阻止酶的过量合成，能够节约生物合成的原料和能量。 酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏。 2.1.1??酶的诱导(Enzyme induction) 按照酶的合成与环境影响的不同关系，可以将酶分为两大类，一类称为组成酶(Structural enzymes)，它们的合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶，在菌体内的含量相对稳定。如糖酵解途径(EMP)有关的酶。另一类酶称为诱导酶(Inducible enzyme)，只有在环境中存在诱导剂(Inducer)时，它们才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止。 诱导酶：在对数生长期的大肠杆菌(E.coli)培养基中加入乳糖，就会产生与乳糖代谢有关的? -半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶等。这时，细胞生长速度和总的蛋白质合成速度几乎没有改变，这种环境物质促使微生物细胞中合成酶蛋白的现象称为酶的诱导。 图2.1. 1. 培养基中加入乳糖诱导?-半乳糖苷酶的合成 早期，诱导酶被称为“适应酶”。有人发现某些细菌只有生长在含淀粉的培养基中才会产生淀粉酶；而曲霉只有生长在含有蔗糖的培养基中才会产生蔗糖酶 Karstron系统地研究了这种适应现象 肠膜状明串珠菌适应酶的生成 预培养基中含糖的种类 能发酵 葡萄糖 乳糖 阿拉伯糖 葡萄糖 ＋ — — 乳糖 ＋ ＋ — 阿拉伯糖 ＋ — ＋ 不含糖 ＋ — — 其后，人们发现适应现象不仅存在于微生物利用某些糖的酶系，微生物对蛋白质、氨基酸及芳香族化合物等的利用也存在这种适应现象。甚至细胞色素和细菌叶绿素也是由适应酶催化生成的。酵母菌在有氧的环境中会生成细胞色素，环境无氧时，细胞色素就消失，再回到有氧环境，又恢复生成细胞色素。紫色细菌的叶绿素在黑暗中消失，见光后又会恢复合成能力。因此，适应酶普遍存在于整个微生物世界中。 Monod和Cohn(1952)在研究大肠杆菌? -半乳糖苷酶适应生成的问题时，发现酶底物(乳糖)的结构类似物，如甲基-? -D-硫代半乳糖苷，也可以象乳糖一样，诱导?-半乳糖苷酶的生成，相反，有些可以作为该酶底物的物质，如苯基-? -D-半乳糖苷，却不能诱导?-半乳糖苷酶的合成。因此，他们将适应酶改称为诱导酶，将诱导酶生成的物质称为诱导物。 在大多数情况下，诱导酶的底物就是有效的诱导物。但是，诱导物不一定就是诱导酶的底物，有些非底物的诱导剂比底物具有更好的诱导效果. 某些诱导酶的正常底物和非底物高效诱导物 酶 正常底物 非底物的高效诱导剂 ?-半乳糖苷酶 乳糖 异丙基-? -D-硫代半乳糖苷 丁烯二酸顺反异构酶 顺丁烯二酸 丙二酸 脂肪族酰胺酶 乙酰胺 N-甲基乙酰胺 甘露糖链霉素酶 甘露糖 α-甲基甘露糖苷 青霉素酶 苄基青霉素 2,6-二甲氧基苯基青霉素 诱导机制：Monod和Jacob(1961)提出操纵子学说解释酶的诱导。操纵子 Operon 指一组功能上相关的基因，它们由启动基因(Promoter)、操纵基因(operator)和结构基因(Structural gene)三部分组成。 启动基因是一种能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基序列，它既是RNA聚合酶的结合位点，又是转录的起始点。操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的碱基序列，它能与阻遏物(Repressor)相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行。结构基因是确定酶蛋白氨基酸序列的DNA模板，可根据它的碱基序列转录生成mRNA，然后再通过蛋白质翻译生成相应的酶。 一个操纵子往往含有多个结构基因，如大肠杆菌的乳糖操纵子中就有三个紧邻的结构基因，分别是?-半乳糖苷酶(水解乳糖)、?-半乳糖苷透过酶(控制乳糖透过细胞膜进入细胞)和半乳糖苷转乙酰酶(催化从乙酰CoA转移乙酰基到半乳糖苷受体上)的遗传基因。 在操纵子附近还有调节基因(Regulator gene)，它是编码调节蛋白(Regulatory protein)的基因。调节蛋白是一类变构蛋白，它有两个特殊的位点，其中的一个位点能与操纵基因结合，另一个能与效应物结合。在酶的诱导中，调节蛋白就是阻遏物。效应物就是诱导物。 在没有诱导物存在时，阻遏物与操纵基因相结合，使得RNA聚合酶无法从起始点滑向结构基因，转录无法进行，结构基因处于休眠状态。当诱导物出现时，阻遏物与诱导物结合，随即发生变构效应。经变构后阻遏物无法再与操纵基因结合，操纵子的“开关”被打开，使结构基因的转录、翻译过程能够顺利进行。当诱导物耗尽后，阻遏物可再与操纵基因结合，操纵子的“开关”又被关上。这时，细胞内已转录生成的mRNA迅速被核酸内切酶降解，操纵子控制的有关酶蛋白在细胞内的含量急剧下降。如果调节基因发生突变，正常的阻遏物无法产生，那么，操纵子的“开关”始终开启着，原有的调节机制被解除，诱导酶就成了组成酶。 酶的诱导分为两种情况：一种是同时诱导，即加入一种诱导剂后，微生物能同时或几乎同时合成几种酶，它主要存在于较短的代谢途径中，合成这些酶的基因由同一个操纵子所控制。例如：将乳糖加入到E.coli培养基中，即可同时诱导? -半乳糖苷酶、?-半乳糖苷透过酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成，这三种酶都由乳糖操纵子控制。另一种称为顺序诱导，第一种酶的底物会诱导第一种酶的合成，第一种酶的产物又可诱导第二种酶的合成，依此类推合成一系列的酶。例如：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。在E.coli中，最初的诱导物乳糖诱导了代谢乳糖酶系的合成，将乳糖转化成半乳糖，半乳糖在细胞内浓度升高，又触发与半乳糖代谢相关酶的诱导合成。 有关分解乳糖酶的顺序诱导 由于存在酶的诱导机制，微生物只有在代谢活动需要时才合成有关的酶，从而避免了营养物和能量的浪费。诱导酶与组成酶在本质上是相同的，两者的区别在于酶合成调节体系受控制的程度不同。在微生物育种中，常采取诱变等手段使诱导酶转化为组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。 2.1.2??酶合成的阻遏(Enzyme repression) 在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶称为阻遏酶(repressible enzyme)。阻遏的生理学功能是节约生物体内有限的养分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种类型。 2.1.2.1??末端代谢产物阻遏(End-product repression ) 由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏称为末端代谢产物阻遏。通常发生在合成代谢中，特别是在氨基酸、核苷酸和维生素的合成途径中十分常见。生物合成末端产物阻遏的特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成。 对数生长期的大肠杆菌的培养基中加入精氨酸，将阻遏精氨酸合成酶系(氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂合酶)的合成，而此时细胞生长速度和总蛋白质的合成速度几乎不变。 图2.1.4 培养基中加入精氨酸阻遏精氨酸合成酶系的合成 若代谢途径是直线式的，末端产物阻遏情况较为简单，末端产物引起代谢途径中各种酶的合成终止。 如大肠杆菌的蛋氨酸是由高丝氨酸经胱硫醚和高半胱氨酸合成的，在仅含葡萄糖和无机盐的培养基中，大肠杆菌细胞含有将高丝氨酸转化为蛋氨酸的三种酶，但当培养基中加入蛋氨酸时，这三种酶消失。 图2.1.5 甲硫氨酸反馈阻遏大肠杆菌的蛋氨酸合成酶的合成?(R)：表示反馈阻遏 鼠伤寒沙门氏杆菌合成组氨酸需要十种酶，这十种酶的合成都同时受到组氨酸的阻遏。有时, 合成途径中各种酶受末端产物阻遏的程度会有所不同，如大肠杆菌的精氨酸生物合成酶系中每个酶受精氨酸阻遏的程度存在着差异。 ?对于分支代谢途径来说，情况比较复杂。每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶，而代谢途径分支点前的“公共酶”则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。任何一种末端产物的单独存在，都不影响酶合成，只有当所有末端产物同时存在时，才能发挥阻遏作用的现象称为多价阻遏(Multivalent repression)。多价阻遏的典型例子是芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮氨酸族氨基酸生物合成中存在的反馈阻遏。 在一些氨基酸合成途径中，末端产物氨基酸必须和它的tRNA结合后，才能起到阻遏作用。有些末端代谢产物本身具有独立的阻遏作用，但若与某些物质结合形成复合物，则会增强阻遏作用。如杆菌肽和F铁离子形成复合物后，反馈阻遏作用增强。 末端代谢产物阻遏在微生物代谢调节中有着重要的作用，它保证了细胞内各种物质维持适当的浓度。当微生物已合成了足量的产物，或外界加入该物质后，就停止有关酶的合成。而缺乏该物质时，又开始合成有关的酶。 ???? 末端代谢产物阻遏的机制也可以用操纵子学说解释。 大肠杆菌色氨酸操纵子控制着5个结构基因，分别为“分支酸-邻氨基苯甲酸-磷酸核糖邻氨基苯甲酸-羧苯氨基脱氧核糖磷酸-吲哚甘油磷酸-色氨酸”途径中5种酶的基因。其调节基因远离操纵子，所表达的调节蛋白不能直接与操纵基因结合，结构基因的表达能顺利进行。这时的调节蛋白称为原阻遏物(prerepressor)。当代谢产生末端代谢产物色氨酸后，色氨酸作为效应物与原阻遏物结合，使后者发生变构效应，并能与操纵基因结合，从而阻止了结构基因的表达。 2.1.2.2??分解代谢物阻遏(catabolite repression) 当细胞内同时存在两种可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。 分解代谢物阻遏过去被称为葡萄糖效应。 】 图2.1.7 培养基中不同糖对大肠杆菌生长速度的影响???1.单独加入葡萄糖时，菌体生长几乎没有延迟期；单独加入乳糖时，菌体生长有明显的延迟期； 2. 同时加入葡萄糖和乳糖时，菌体呈二次生长 分解代谢物的阻遏机制：乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点。CAP是降解物基因活化蛋白(又称为cAMP受体蛋白)，当CAP与cAMP结合后，就会被活化，复合物又会激活启动基因，并使RNA 聚合酶与启动基因结合。 分解代谢物的阻遏机制：在只含有乳糖的培养环境中，乳糖操纵子的“开关”开启，三种与乳糖代谢有关的酶能被顺利合成，而当乳糖与葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物(X)，X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成。 在如葡萄糖培养基中的大肠杆菌细胞内，cAMP浓度比生长在乳糖培养基中的低1000倍，只有当葡萄糖耗尽后，cAMP才能回升到正常浓度，操纵子重新开启，并开始利用乳糖作为碳源，形成菌体的二次生长。 分解代谢物阻遏的乳糖操纵子模型(葡萄糖分解代谢物X阻止CAP-cAMP的形成，从而阻止了RNA聚合酶与启动基因上结合位点(RNApol.)的结合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代谢有关的酶仍无法合成) 图2.1.8 大肠杆菌在含葡萄糖和山梨醇培养基中的二次生长???1.葡萄糖50微克/毫升，山梨醇150微克/毫升；九游会股份有限公司2.葡萄糖100微克/毫升，山梨醇100微克/毫升；3.葡萄糖150微克/毫升，山梨醇50微克/毫升 酶的诱导、分解代谢物阻遏和末端产物阻遏可以同时发生在同一微生物体内。 当某些底物存在时微生物内就会合成诱导酶，几种底物同时存在时，优先利用能被快速或容易代谢的底物；而与代谢较慢的底物有关酶的合成将被阻遏；当末端代谢产物能满足微生物生长需要时，与代谢有关酶的合成又被终止。 2.2??酶活性的调节 通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的调节方式称为酶活性的调节。与酶合成调节方式相比，这种调节方式更直接，并且见效快。是发生在蛋白质水平上的调节。 某些酶的活性受到底物或产物或其结构类似物的影响，这些酶称为调节酶(Regulatory enzyme)。这种影响可以是激活、也可以是抑制酶的活性。我们把底物对酶的影九游会股份有限公司响称为前馈，产物对酶的影响称为反馈。前馈作用一般是激活酶的活性。如粪链球菌(Streptococcus feacalis)的乳酸脱氢酶活性可被1,6-二磷酸果糖所激活；又如在粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)培养时，柠檬酸会促进异柠檬酸脱氢酶活性。 调节酶通常是变构酶，一般具有多个亚基，包括催化亚基和调节亚基。激活过程的效应物称为激活剂(activator)，而抑制过程的效应物称为抑制剂(inhibitor)。 图2.2.2 变构酶受效应物的调节过程1. 激活剂激活无活性的酶；2.抑制剂抑制有活性的酶 在微生物代谢调节中更常见的是反馈调节，尤其是末端产物对酶活的反馈抑制。调节酶的抑制剂通常是代谢终产物或其结构类似物，作用是抑制酶的活性。效应物的作用是可逆的，一旦效应物浓度降低，酶活性就会恢复。调节酶常常是催化分支代谢途径一系列反应中第一个反应的酶，这样就避免了不必要的能量浪费。酶的活性受到细胞能荷的调节 能荷（Energy charge）:细胞中的能量状态 [ATP]+[ADP]/2 EC=_______________________ [ATP]+[ADP]+[AMP] 系统中只有ATP时，EC值为1；只有AMP时，EC值等于零。大肠杆菌在生长期的EC值为0.8，稳定期时逐渐降低到0.5，当EC值小于0.5时，细胞将死亡。 能荷不仅能调节分解代谢形成ATP的酶活性，也能调节合成代谢利用ATP的酶活性。如异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等会受到高能荷的抑制，而丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶和天门冬氨酸激酶等会受到高能荷的激活。 巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。这种呼吸抑制发酵作用的的现象被后人称为巴斯德效应(Pasteur effect)。巴斯德效应的本质是能荷调节。 糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)途径都能产生ATP。有氧条件下，TCA循环活泼，呼吸链的氧化磷酸化大量合成ATP，细胞能荷增加，异柠檬酸脱氢酶受到ATP抑制，导致柠檬酸的积累，柠檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制剂，从而限制了葡萄糖的利用速度。在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生ATP，细胞能荷较低，ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。 2.3??微生物代谢调节的模式 ?在微生物合成代谢过程中，反馈阻遏和反馈抑制往往共同对代谢起着调节作用，它们通过对酶的合成和酶的活性进行调节，使细胞内各种代谢物浓度保持在适当的水平。 反馈阻遏（ feedback repression ）与反馈抑制（ feedback inhibition ）的性质比较 ? 反馈阻遏 反馈抑制 调控对象 酶的合成 酶的活性 调控开关 终产物浓度 终产物浓度 调控的水平 DNA-mRNA-酶蛋白（转录水平） 酶蛋白的构象变化 调控方式 终产物与阻遏蛋白亲和力 终产物与变构部位亲和力 调控动作 阻遏蛋白与操纵基因结合，不能合成mRNA 通过变构效应，酶的构象变化 对酶的影响 影响催化一系列反应的多个酶 只对是一系列反应中的第一个酶起作用 形成的控制 开、关控制 控制酶活性大小 调控反应速度 迟缓 迅速 2.3.1??直线式代谢途径的反馈控制 ??对于只有一个末端代谢产物的途径，即直线式代谢途径，当末端代谢产物达到一定浓度时，就会反馈控制该代谢途径。末端产物的反馈阻遏一般是阻止该途径中所有酶的合成，末端产物抑制一般是抑制该途径第一个酶的活性。 图2.3.1 直线式末端产物反馈控制 在研究大肠杆菌的异亮氨酸合成途径时，首先发现了直线式代谢途径的反馈抑制。苏氨酸是合成异亮氨酸的前体，在培养基中给苏氨酸缺陷型大肠杆菌补充苏氨酸时，该菌株可以合成异亮氨酸，但若同时在培养基中添加异亮氨酸，就不能利用苏氨酸合成异亮氨酸了。这是因为异亮氨酸抑制了由苏氨酸转化为异亮氨酸途径的第一个酶，即L-苏氨酸脱氨酶。 图2.3.2 异亮氨酸合成途径中的直线式反馈抑制 大肠杆菌中由氨甲酰磷酸和天门冬氨酸合成胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)时需要七种酶，当CTP达到一定浓度后，便反馈抑制催化第一个反应的酶，即天门冬氨酸转氨甲酰酶。 图2.3.3 大肠杆菌CTP合成途径中的直线式反馈抑制 反馈阻遏还有另一种形式，即末端产物阻遏与中间产

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