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　　微生物的代谢调节 3.1 微生物的代谢类型 和自我调节 分解代谢和合成代谢分解代谢：将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为细胞的生命活动提供能源和小分子中间体。如TCA、EMP和HMP等。合成代谢：利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。 初级代谢和次级代谢初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素，其它还有氨基糖、香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。 经济合理地利用和合成所需的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。微生物代谢调节的原则 在长期的进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格地控制代谢活动，使之有序而高效地运行，并能灵活地适应外界环境，最经济地利用环境中的营养物。 研究微生物的代谢调节，不仅有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生物和为微生物提供最适合的环境条件，使微生物能最大限度地生产人类所需的代谢产品。从某种意义上讲，越是理想的高产菌株，背离它自然进化中发展起来的调控机制就越远。遗传育种工作就是为获得目标代谢产物合成不受或少受代谢调控的“不正常”的菌株。 微生物自我调节的部位（1）通道：细胞膜，输送物质有些是需能的，受ATP的影响和透性酶活性调节。（2）通量：调节现有的酶量和改变已存在的酶分子的活性来控制代谢物通量。（3）限制基质的有形接近：酶体系的区域化可使细胞内的一些酶的活性受到调节和整合。 原核生物细胞代谢模式图1—底物的摄入，产物的排出 2—酶的作用 3—酶或透性酶的合成 ★ 酶活性调节：通过改变酶分子的活性来调节代谢速度。直接，见效快，是发生在蛋白质水平上的调节。★ 酶合成调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度。间接，缓慢，在基因转录水平上进行。优点是通过阻止酶的过量合成，能节约生物合成的原料和能量。酶促反应的调节方式： 3.2 酶活性调节 酶活性调节包括两个方面，即酶的激活作用和酶的抑制作用。 3.2.1 酶的激活作用和抑制作用激活作用：在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后，导致原来无活性或活性很低的酶转变为有活性或活性提高，使酶促反应速率提高的过程。抑制作用：在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。 这种能引起酶的活力提高（或获得）或降低（或丧失）的物质称为酶的激活剂或抑制剂。 可以是外源物质或机体自身产生与积累的代谢产物 3.2.2 酶活性调节的机制变构理论：通过酶分子空间构型上的变 化来改变酶活性共价修饰调节理论：通过酶分子化学组成 上的改变来调节酶活性 （1）变构调节理论变构酶：可以随着条件的变化，改变其分子的空间构型。一般具有多个亚基。除了有可以结合底物的活性中心外，还有可以结合调节物的调节中心。这两个中心位于酶蛋白的不同部位上或处在不同的亚基上，或处在同一个亚基的不同部位上。 （2）酶的共价修饰 指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。 a) 可逆共价修饰 现在已知有相当多的酶能以两种形式存在，它们具有不同水平的催化活性，并且这两种形式能在其他酶的作用下进行可逆互变。 其中了解最多的是磷酸化/脱磷酸化、腺苷酰化/脱腺苷酰化调节。 不可逆共价修饰 无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活。共价键断裂造成不可逆的酶活性变化也是酶共价调节的一种形式。 3.2.3 能荷调节 能荷调节形成ATP的分解代谢酶类和利用ATP的生物合成酶类的活性。许多细胞都可以通过调节腺苷酸的比例，来协调分解代谢与合成代谢的速率。 3.3 酶合成的调节酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏 3.3.1 酶合成的诱导作用 诱导作用指在某种化合物（包括外加的和内源性的）作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。 组成酶：合成与环境无关，随菌体形成而合 成，是细胞固有的酶，在菌体内的 含量相对稳定。如EMP途径有关的酶。诱导酶：依赖于诱导剂（某种底物或底物的 结构类似物）的存在而合成。 如：大肠杆菌半乳糖AG九游会官网苷酶 ——乳糖、对硝基苯-α-L-阿拉伯糖苷 甲基-β-硫代半乳糖苷 为什么会产生酶的诱导作用？操纵子学说操纵子指一组功能上相关的基因，它们由启动基因、操纵基因和结构基因三部分组成。 在操纵子附近有调节基因，它编码合成调节蛋白。调节蛋白是一类变构蛋白，它有两个特殊的位点，其中的一个能与操纵基因结合，另一个能与效应物结合。 在酶的诱导中，调节蛋白就是阻遏物，效应物就是诱导物。 如果调节基因发生突变，正常的阻遏物无法产生，那么，操纵子的“开关”始终开启着，原有的调节机制被解除，诱导酶就成了组成酶。 在微生物育种中，常采取诱变等手段使诱导酶转化为组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。 3.3.2 酶合成的阻遏 微生物在代谢过程中，当胞内某种代谢产物积累到一定程度时，可以反馈阻遏该产物合成途径中前面某种酶的继续合成，从而降低此产物的合成速率。酶合成的阻遏主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种类型。 末端产物阻遏甲硫氨酸反馈阻遏大肠杆菌的蛋氨酸合成酶的合成（R）—表示反馈阻遏普遍存在于氨基酸、核苷酸生物合成途径中 分解代谢物阻遏葡萄糖效应？ 当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。现在知道，这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。 3.4 微生物代谢调节 的模式 什么是反馈？ ——通常把产物对酶的影响称为反馈。 在微生物代谢调节中常见的是反馈调节，反馈阻遏和反馈抑制往往共同对代谢起着调节作用，它们通过对酶的合成和酶的活性进行调节，使细胞内各种代谢物浓度保持在适当的水平。 反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系列反应的多个酶，而后者往往只对一系列反应中的第一个酶起作用。 3.4.1 直线式代谢途径的反馈调节 对于只有一个末端代谢产物的途径，即直线式代谢途径，当末端代谢产物达到一定浓度时，就会反馈控制该代谢途径。末端产物的反馈阻遏一般是阻止该途径中所有酶的合成，末端产物抑制一般是抑制该途径第一个酶的活性。 3.4.2 分支代谢途径的反馈调节 由几种末端代谢产物共同对生物合成途径进行控制的体系较为复杂，即便是同一代谢途径，不同菌种也会有不同的控制模式。这些控制可以是反馈阻遏或反馈抑制单独作用的结果，也可以是两者共同作用的结果。 （1）协同反馈调节 分支代谢途径的几个末端产物同时过量时，该途径的第一个酶才会受到反馈阻遏或反馈抑制。 如多粘芽孢杆菌在合成天门冬氨酸族氨基酸时，天门冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。如果仅是赖氨酸或苏氨酸过量，并不能引起抑制作用。 （2）累积反馈调节 每个分支途径的末端产物都独立于其他末端产物，以一定百分比控制该途径第一个共同的酶所催化的反应。当几个末端产物同时存在时，它们对酶反应的抑制是累积的，各末端产物之间既无协同效应，也无拮抗作用。如图所示，D和F分别独立地抑制第一个酶活性的30%和40%，那么，当D和F均过量时，它们对第一个酶的总抑制是58%，即100%-（100%-30%）×（100%-40%）=58%。 （3）合作反馈调节（增效反馈调节） 这类控制休体系与协同反馈控制类似，但是该体系中的末端产物都有较弱的独立控制作用。当所有的末端产物同时过剩时，会导致增效的阻遏或抑制，即其阻遏或抑制的程度比这些末端产物各自独立过量时的总和还要大，因此，又称为增效反馈调节。 （4）顺序反馈调节 在顺序反馈控制体系中，直接对第一个共同的酶起控制作用的并不是末端产物，而是分支点上的中间产物。如下图所示，每个末端产物均对紧接分支点B后导向各自分支途径的酶进行控制，D抑制B向C反应，F抑制B向E反应，D、F单独或两者共同的抑制作用将导致B的积累，过量的B又会抑制A向B的反应。顺序反馈调节存在于枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成和球形红假单孢杆菌苏氨酸合成的代谢途径。 （5）同工酶调节同工酶又称同功酶，是指催化相同的生化反应，但酶蛋白结构有差异，而且控制特征也不同的一组酶的通称。如果代谢途径中某一反应受到一组同工酶的催化，那么不同的同工酶可能受各不相同的末端产物控制。实例：大肠杆菌天冬氨酸族氨基酸合成代谢中的调节作用 3.5 次级代谢的 调节控制 微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节。次级代谢产物生物合成的调节与其他微生物产物生物合成的调节在某些方面是相同的，也是调节参与生物合成的酶合成（诱导或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次级代谢的调节也有其独特的一面。 3.5.1 初级代谢对次级代谢的调节 次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的，而是与初级代谢产物合成途径间存在着紧密的联系。 次级代谢产物往往都是以初级代谢产物为母体衍生而来的，而且催化特殊次级代谢产物合成反应的酶也可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。因此，微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。 当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制α-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。 3.5.2 碳代谢物的调节 一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生物合成都表现出抑制作用。这种抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的结果，而是由于其代谢过程中产生的中间产物引起的。这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。 20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较为缓慢，却能提高青霉素产量。已知有许多次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素、丝裂霉素、杆菌肽、新生霉素、放线菌素和香豆素等的生物合成都受到葡萄糖的阻遏，因而在这些产物的发酵过程中常采用其他碳源。 3.5.3 氮代谢物的调节许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；而以无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（胺盐、硝酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，但对链霉素合成则是最差的氮源。 3.5.4 磷酸盐的调节 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。 ★已发现过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯类、大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度≥ 10mmol/L 往往对次级代谢产物的合成有抑制作用例如， 10mmol/L的磷酸盐就能完全抑制杀假丝菌素的合成 ★磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等的发酵都有这些现象。★磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。 3.5.5 ATP调节ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。在四环素的生物合成中，ATP水平对四环素合成起调节作用。磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再经羧基转移酶作用生成丙二酰CoA（四环素合成的前体），此途径在四环素合成期起决定作用。而草酰乙酸是三羧酸（TCA）循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。 3.5.6 酶的诱导调节在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。诱导酶需要有诱导物存在才能形成。诱导物起诱导作用，能提高次级代谢产物的产量。例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导作用，而不是作为硫源的供给物。诱导酶合成的诱导剂有些需外源加入，而有些是菌体代谢过程中自身产生的。在抗生素的发酵过程中，有的初级代谢产物似乎对次级代谢产物的合成酶也起诱导作用。 3.5.7 反馈调节★一方面是次级代谢产物本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。如氯霉素、卡那霉素、泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。★另一方面，初级代谢和次级代谢途径是紧密相连的，初级代谢受到的反馈调节，也必然影响次级代谢产物的合成。 3.5.8 细胞膜通透性调节次级代谢中也存在着膜通透性调节。菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果细胞对某种物质不能运输，或是运输功能发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和收获；或者是细胞外的营养物质不能进入菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长和产物的合成，造成产量下降。 在青霉素的发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物的能力是影响青霉素发酵单位的一个重要因素。诱变选育出来的青霉素高产菌株中，有些变株就是因为改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更容易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，最终提高了青霉素的产量。 细胞膜通透性是代谢调节的一个重要方面，可以通过改变某些次级代谢产物产生菌的膜通透性来提高其产量。 3.5.9 金属离子和溶解氧的调节★在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如， Mg 2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。 ★有些金属离子（如Mg 2+和Ca 2+等）可解除产生菌（卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌）对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。★还有一些金属离子（如Mg 2+）可增加产生菌对所产抗生素的抗性。 次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。例如，由青霉素N进行头孢菌素合成时，随着氧分压的增大头孢菌素的合成就促进，同时加入KCN或降低搅拌速度合成量则减少。 3.6 代谢调控 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓代谢的人工控制。 3.6.1 发酵工艺条件的控制（1）控制不同发酵条件 如：啤酒酵母培养 生成乙醇（中性或酸性） 产生甘油（碱性或加入Na2SO3） （2）使用诱导物 有效地增加诱导酶的产量 如：木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖可诱导纤维素酶的产生，木糖可诱导半纤维素酶的生成。 青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。 （3）添加生物合成的前体 在发酵中加入邻氨基苯甲酸，虽然色氨酸对第一个酶的反馈抑制仍存在，但对由邻氨基苯甲酸合成色氨酸并无影响，使色氨酸的合成可不断进行，从而大幅度提高了发酵产量。 （4）控制培养基成分和浓度 避免由于培养基的不当使用引起的分解代谢物阻遏。如：果糖 甘油 （嗜热脂肪酵母） 使淀粉酶产量提高25倍以上 乳糖 甘露糖 （荧光假单胞菌） 使纤维素酶产量提高1500倍以上 3.6.2 改变细胞通透性 在发酵过程中，控制使用那些影响细胞膜通透性的物质，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了末端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。 谷氨酸过量生产举例： 利用棒状杆菌的酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，在葡萄糖增养基中发酵生产谷氨酸，当达到50 mg/g（干细胞）时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。改变细胞膜通透性，使胞内代谢产物渗透到胞外，有利于提高发酵产量。 改变细胞通透性的方法（1）限制生物素（1~5 mg/L)——控制细胞膜中脂质的合成（2）加入青霉素——抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联（3）加入表面活性剂，如吐温80等——将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加。（4）控制Mn2+、Zn2+浓度——干扰细胞膜或细胞壁的形成（5）筛选细胞透性突变株 3.6.3 改变菌种遗传特性诱变育种营养缺陷型突变株、抗反馈调节突变株、组成型突变株、抗性突变株等 工业上利用抗反馈调节突变株生产的氨基酸，如： L-精氨酸、 L-组氨酸、 L-异亮氨酸、 L-苏氨酸等。 3.7 代谢工程 什么是代谢工程？ ——指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术。 代谢网络理论代谢物流的定量和物流的控制

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